大約在設計《安加里之戰》的同時，達芬奇已在著手另一幅氣氛完全不同的作品，也就是被稱為《蒙娜麗莎》的著名肖像畫。這也是達芬奇在第二次佛羅倫斯時期流傳下來唯一完整的作品。關於這幅作品的創作動機，有這麼一種說法﹕達芬奇看到年輕氣盛的對手米開蘭基羅創作《大衛》後廣受愛戴，心中頗不是滋味；激起了他也想在繪畫領域創作一幅驚世之作的野心，於是有了這栩栩如生的《蒙娜麗莎》。不論事實如何，達芬奇確實對這幅作品十分看重，在日後遷移時總是帶著它。這幅畫最後隨著終老於法國的達芬奇到了異鄉，達芬奇死後歸法國王室所有，最後成為盧浮宮的鎮館之寶。
《蒙娜麗莎》（Mona Lisa）是Madonna Lisa 的簡稱，是達芬奇為佛羅倫斯商人喬康朵（Francesco di Bartholommeo del Giocondo）的妻子所作的肖像，所以又叫《喬康達夫人》。畫中女子穿著佛羅倫斯的時尚服飾，雙手交疊，優雅端莊地坐在達芬奇假想的風景前。她帶著淺淺的笑意 ，眼神意味深長地凝視著觀眾。然而，正是這瓦薩利形容為「非人世」的神秘笑容，幾百年來不知迷惑了多少藝評家和史學家。
《蒙娜麗莎》又名《喬康達夫人》（La Gioconda），1503-06
技法
一般人對《蒙娜麗莎》一作的評價極高，認為是文藝復興肖像畫的典範。藝術家兼傳記作者瓦薩利就認為《蒙娜麗莎》是模仿自然的極致之作 。確實，從技法的角度看來，達芬奇對人物的描寫無懈可擊，從對外形（結構比例、肌理、明暗）的掌握到內心的刻畫，用「栩栩如生」形容毫不為過。特別是達芬奇將暈塗法 （Sfumato）運用得爐火純青，光影的變化「如煙似霧」般地不著痕跡，不用輪廓而純粹以明暗將肌體塑造成形 — 這是繪畫技術的一大突破，也是達芬奇對後人影響至深的一點。暈塗法並不是達芬奇的發明，但是達芬奇偏好以柔和光線處理明暗 ，因而將暈塗法發揮得淋灕盡致；《蒙娜麗莎》也成了暈塗法的最佳範例。「暈塗法」造成的朦朧、模糊等「不確定」效果，容易造成視覺上的錯覺和想像空間，所以蒙娜麗莎的眼角、嘴角、臉頰等處若有似無的陰影，正是決定其表情似笑非笑、難以捉摸的原因。
微笑
《拈花聖母》中聖母童真的笑容
達芬奇作品中微笑的表情並不少見，但早期除了《拈花聖母》，大多數表情都屬於內斂的，即是笑意也是溶在臉部肌肉的細微光影中。如《岩窟聖母》中聖母和天使的詳和面容上，隱現的笑意呈現了母性和慈愛。晚年的達芬奇似乎更致力於追求一種理想中的永恆微笑。從聖母子和聖安娜的草圖，和幾張人物素描習作，我們發現了達芬奇的微笑典型﹕溫婉安詳的女性臉龐上，低垂的眼皮令人想起東方的菩薩；微微上揚的嘴角牽動著輕微隆起的雙頰和淺淺的酒窩，優雅溫馨，是「善」與「美」的結合。
然而《蒙娜麗莎》僅管表現手法上和前述的作品近似，給人的感受卻不同。她雙眸直視觀眾，觀眾與之「四目相對」時，感到面對的是活生生的注視（當然這也是達芬奇技法高超的表現之一），特別在畫面幽暗的氛圍下，似笑非笑的表情令人有著莫名的不安。或許因為光影細緻得難以察覺，一切是不明確、不穩定的，所以從不同角度、不同光線下，或從不同的印刷版本觀之，她的表情都不盡相同，乍看是安詳可親的，細看又顯出狡黠與心機；其神態無疑是從容高貴的，但似乎又帶著輕蔑嘲弄…所以幾百年來認為蒙娜麗莎的微笑「詭異」、「邪氣」、「魅惑」的也大有人在。達芬奇確實把相反的性質溶合在一個表情中，這是最令人費解的地方。
英國的藝評家瓦爾特．派特（Walter．Pater）在他1867年關於《蒙娜麗莎》的短文中就有以下的形容﹕「…作品凝聚了世上各種思想與經驗…希臘的獸性，羅馬的色慾，中世紀的神秘主義，以及波吉亞的罪孽（註）。蒙娜麗莎比畫中的岩石還要老，一如吸血鬼般死去多次，深知墓穴的秘密…」蒙娜麗莎彷彿成了不死的精怪，幾百年來在人們仰慕的注視下持續吸取著能量…，她好似窺見了人性的秘密，自信地回敬每一個注視她的眼神。令人不禁納悶，投注了四年的精力在這幅畫上的達芬奇當時到底是什麼心態，又如何畫出這麼一個「精靈」來的。
當然，如果達芬奇真的是帶著妒忌心和爭鬥心，為了和米開蘭基羅一較高下而創作了《蒙娜麗莎》，創作中起心動念並不善，也可能使畫中的信息不夠純淨。
而達芬奇筆下的聖母子或天使，就沒有給人這種複雜的感受。事實上，畫家在畫神和畫人的時候心態是不同的。人性是複雜的；帶著七情六欲；畫家在畫人的時候，畫家自己和畫中人物的一切信息都帶在畫中 。而畫神的時候，畫家會為了表現神的慈悲和光明而自覺或不自覺的純淨自我，作品散發出來的也必然是善與光明。這或許可以說明為何達芬奇的聖母、聖安娜和天使有聖潔慈祥之感，笑容也較蒙娜麗莎純淨許多。
背景
蒙娜麗莎身後的地平線高低不一，水面甚至反常地傾斜
通常畫家會把他生平的閱歷、知識、喜好反映在作品中，達芬奇自然也不例外。背景中的山岩、地形、水文、橋梁，包括空氣、雲層等等大自然的一切，都是達芬奇長期研究和觀察的對象，甚至是他親身執掌過的工作項目。達芬奇曾說﹕「徹底明白各個細節後，即能了解全體。」他對這些自然現象了暸若指掌，在背景中將它們熔鑄成為一有機的整體，並且恰如其分地烘托著前景的人物。
當然，我們不得不提到達芬奇善用的「空氣遠近法」（又叫『大氣透視法』，Aerial perspective; Atmospheric perspective）在此的重要角色。達芬奇觀察到的空氣宛如一層薄霧（薄紗）籠罩著大地，越遠的物體輪廓越模糊，色彩越輕淡，甚至偏藍色。所以這種「空氣遠近法」純粹運用色彩層次變化和柔軟的筆調，無需消失點透視法就能將遠近關係表現得自然而分明。這種技法達芬奇在早期作品如《天使報喜》、《康乃馨聖母》中就已經運用自如了。
然而這幅畫的背景真的完美無缺嗎？眼尖的人注意到了背景的地平線左右高低不一。但由於對達芬奇的信賴，幾乎沒有人認為這會是達芬奇的失誤 — 追求完美的達芬奇怎麼會犯這樣明顯的錯誤呢？於是藝評家找到了合理的解釋﹕這是達芬奇的匠心獨具，高低不一的地平線使得觀者的視線從左邊移到右邊時，或從右邊移到左邊時，會有蒙娜麗莎突然降低或升高的錯覺，使得畫中人更有靈動感。或許真是這樣。但奇怪的是，右邊的地平線（水平線）不但高于左邊，還呈現不合理的傾斜（左高右低）；而且水面僵硬突兀，和左邊人物或遠山都格格不入，這就與人物的動感毫無關係了。以達芬奇的水準而言，可說是敗筆。
如何解釋這個瑕疵？一個合理的說法是這幅畫尚未完成，一直未能達到達芬奇最終的理想，這也是何以達芬奇一直將畫帶在身邊的緣故；當然也可能是外人難以了解的畫家個人因素…不論達芬奇有意還是無意，這缺陷一如蒙娜麗莎亦善亦邪的表情一樣的令人迷惑。
這幅畫完成後就享有盛名，但是也歷經了不少「劫難」。有專家認為蒙娜麗莎的兩側原來各有一根柱子，但不知何時被人裁去了；1911年，蒙娜麗莎在盧浮宮的方形大廳（Salon Carée），被一位「愛國」的義大利工人Vicenzo Perrugia偷走；震驚一時。1913年《蒙娜麗莎》在佛羅倫斯被找到，在烏菲茲美術館展出後，輾轉經過羅馬和米蘭，在同年12月終於還是回到了巴黎。1956年，一個瘋子向這幅名畫潑酸；1960年又被人惡意割了一道痕跡。如今修復後的《蒙娜麗莎》被保護在特製的防彈玻璃內，1980年法國還特別通過法律禁止這件作品離開法國境內，可見世人對它重視的程度。
許多人認為蒙娜麗莎達代表了女子的典型之美，典雅、端莊，蘊涵著智慧和自信等。但是也因為她的盛名，這個「典範」經常被浮濫的模仿、複製。她經常成為美學、哲學的象徵或是商品廣告的代言；在現代藝術中卻又成為達達和超現實主義的反諷對象。很少有哪一件藝術作品像《蒙娜麗莎》那樣既被推崇又被大膽地惡搞 — 這多少也呼應了作品本身具有的矛盾性質。